手性色譜柱是由具有光學活性的單體，固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。通過引入手性環境使對映異構體間呈現物理特征的差異，從而達到光學異構體拆分的目的。要實現手性識別，手性化合物分子與手性固定相之間少存在三種相互作用。這種相互作用包括氫鍵、偶級-偶級作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用。

手性分離效果是多種相互作用共同作用的結果。這些相互作用通過影響包埋復合物的形成，特殊位點與分析物的鍵合等而改變手性分離結果。由于這種作用力較微弱，因此需要仔細調節、優化流動相和溫度以達到佳分離效果。